اكتشف كيف يمكنك الحفاظ على جودة الانسجة لفترة اطول باستخدام هذه المثبتات

يمكن تحقيق تثبيت الأنسجة بالوسائل الكيميائية أو الفيزيائية. تشمل الطرق الفيزيائية التسخين، والتلويح الدقيق، والحفظ بالتبريد (التجفيف بالتجميد). نادراً ما يستخدم التثبيت الحراري في عينات الأنسجة، حيث يقتصر تطبيقه على مسحات الكائنات الدقيقة. ومع ذلك، فإن التثبيت بالميكروويف، والذي يمكن اعتباره شكلاً من أشكال التثبيت الحراري، يُمارس الآن على نطاق واسع في المختبرات الروتينية.

الحفظ بالتبريد، عادة في شكل تجفيف بالتجميد له بعض التطبيقات في كيمياء الأنسجة ولكن لا يتم تطبيقه عادة على عينات الأنسجة التشخيصية.

يتم تحقيق التثبيت الكيميائي عادةً عن طريق غمر العينة في المثبت (التثبيت الغاطس) أو، بعض الأعضاء الكاملة مثل الرئة، عن طريق إرواء نظام الأوعية الدموية بالمثبت. بالنسبة لبعض الإجراءات الكيميائية النسيجية المتخصصة، تم تطبيق المثبتات من حين لآخر في شكل بخار. على سبيل المثال يمكن استخدام بارافورمالدهيد ورباعي أكسيد الأوزميوم من شركة بيو اوبتيكا الإيطالية (Bio Optica) لإصلاح الأنسجة المجففة بالبخار.

قد تحتوي المحاليل المثبتة على عامل مثبت واحد مذاب في مذيب مثل الماء أو الكحول أو بشكل أكثر شيوعًا، محلول منظم لتثبيت الأس الهيدروجيني. تحتوي بعض حلول التثبيت الشائعة على العديد من عوامل التثبيت المختلفة معًا، والسبب المنطقي هو أنه يمكن تعويض العيوب في عامل واحد بإضافة عامل آخر. على سبيل المثال، يوجد حمض الأسيتيك في بعض التركيبات لمواجهة الانكماش الناجم عن عوامل أخرى مثل الإيثانول.

يمكن اعتبار التثبيت "سلسلة معقدة من الأحداث الكيميائية". على الرغم من أنه يمكننا الآن تحديد بعض هذه "الأحداث"، فإن فهمنا للكثير مما يحدث أثناء التثبيت لا يزال غير مكتمل. تحتوي الخلايا والمكونات خارج الخلية على الببتيدات والبروتينات والدهون والفوسفوليبيدات (الأغشية) والكربوهيدرات ومجمعات الكربوهيدرات وأنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي وما إلى ذلك. تعتمد الطريقة التي ستتفاعل بها هذه العناصر أثناء التثبيت على نوع التثبيت وعامل التثبيت المستخدم وظروف التثبيت. ستتفاعل بعض عناصر الأنسجة كيميائياً مع المثبت، ويتم تثبيتها عن طريق الارتباط المتقاطع وبالتالي الحفاظ عليها، وقد لا يتأثر البعض الآخر بالمثبت ولكن محاصر داخل خلية أو نسيج بواسطة عناصر ثابتة أخرى.

يُطلق على عوامل التثبيت التقليدية اسم "التخثر" أو "غير المخثر" بناءً على تأثيرها على البروتينات القابلة للذوبان في المحلول. قيل إن المثبتات المخثرة تؤدي إلى شبكة نفاذة من خيوط البروتين، في حين أن المثبتات غير المخثرة التي هي مضافة بطبيعتها، شكلت روابط متقاطعة واسعة النطاق تنتج هلامًا أقل نفاذية. لا تزال هذه المصطلحات موجودة في الأدبيات النسيجية الحديثة ولكن تم مؤخرًا اتباع نهج أكثر منهجية في التصنيف.

هناك آليتان رئيسيتان مهمتان في تثبيت البروتينات ومجمعات البروتين: التمسخ ، والإضافة والتكوين المتقاطع.

التمسخ: يحدث هذا التأثير بشكل شائع بسبب مواد التجفيف مثل الكحول أو الأسيتون. تقوم هذه الكواشف بإزالة واستبدال الماء الحر في الخلايا والأنسجة وتسبب تغيرًا في البنية الثلاثية للبروتينات عن طريق زعزعة استقرار الرابطة الكارهة للماء. المناطق الكارهة للماء، التي توجد بشكل متكرر في داخل جزيئات البروتين، يتم إطلاقها من تنافر الماء وتصبح حرة لتحتل مساحة أكبر. في المناطق المحبة للماء، ترتبط جزيئات الماء البروتينية بشكل فضفاض بالروابط الهيدروجينية، كما يؤدي إزالة الماء إلى زعزعة استقرار هذه الروابط. تؤدي التغييرات الناتجة في تكوين جزيئات البروتين إلى تغيير في قابلية ذوبان البروتين ، مما يجعل البروتينات القابلة للذوبان في الماء غير قابلة للذوبان ، وهو تغيير لا رجوع فيه إلى حد كبير إذا تم إرجاع البروتين إلى بيئة مائية.

الإضافة والتشكيل المتقاطع: تتفاعل عوامل التثبيت غير المتخثرة كيميائيًا مع البروتينات ومكونات الخلايا والأنسجة الأخرى، وتصبح مرتبطة بها عن طريق الإضافة وتشكيل روابط متقاطعة بين الجزيئات وداخل الجزيئات. نظرًا لأن هذه العوامل عبارة عن مركبات تفاعلية، فإنها ترتبط بمجموعة متنوعة من المجموعات الكيميائية في الأنسجة، وغالبًا ما تؤثر على الشحنة في موقع الارتباط. يمكن أن يكون لهذا تأثير على خصائص التلوين اللاحقة لبروتين معين وكذلك تغيير شكله الجزيئي وبالتالي قابليته للذوبان. على سبيل المثال، النسيج المثبت ببقع الفورمالديهايد ( Formaldehyde ) ضعيف مع اليوزين لأن الفورمالديهايد يتفاعل بشكل مكثف مع المجموعات الأمينية لتشكيل جسور الميثيلين، وبالتالي لم تعد هذه المجموعات متاحة لربط جزيئات الصبغة سالبة الشحنة مثل جزيئات يوزين.

يختلف إلى حد كبير إلى أي مدى تشكل المثبتات المضافة روابط متقاطعة. على سبيل المثال، يعتبر الجلوتارالدهيد ( Glutaraldehyde ) أكثر فعالية في تكوين الروابط المتقاطعة من الفورمالديهايد. وهذا يفسر لماذا يحافظ بشكل فعال على البنية التحتية للخلايا وهو المثبت المفضل للفحص المجهري الإلكتروني. كما يفسر سبب تلطيخ الأنسجة الثابتة بالجلوتارالدهيد بشكل سيئ باستخدام طرق الصبغ التقليدية. التفاعلات الكيميائية لتثبيت الأنسجة مفهومة جيدًا في حالة بعض العوامل مثل الفورمالديهايد ، لكن معرفتنا بالآليات المرتبطة ببعض العوامل الأخرى غير كاملة.

أظهرت طرق استرجاع المستضد في الكيمياء الهيستولوجية المناعية أن بعض تفاعلات التثبيت قابلة للعكس، لا سيما تفاعلات الفورمالديهايد ، ولكن هناك تباينًا كبيرًا في جودة حفظ المستضد مع عوامل مختلفة. أصبح الحفاظ على الأنتيجينيسين من الاعتبارات المهمة للغاية عند اختيار المثبت.

يعد تثبيت الأنسجة أحد أهم أجزاء عملية الأنسجة. يجب أن يكون للمثبت القدرة على منع التدمير القصير والطويل المدى للبنية الدقيقة للأنسجة عن طريق إيقاف نشاط الإنزيمات التقويضية وبالتالي التحلل الذاتي، مما يقلل من انتشار الجزيئات القابلة للذوبان من مواقعها الأصلية.